大黄中游离蒽醌的提取、分离和鉴定
一、简介
大黄为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Baill)的干燥根及根茎。味苦，性寒。具有泄热通肠，凉血解毒，逐瘀通经的功效。因炮制方法不同，功效各有所主。大黄的主要成分为蒽醌衍生物，总量为3% ~5%，部分游离，大部分以苷的形式存在。大黄的抗菌、抗感染有效成分为大黄酸、大黄素和芦荟大黄素，表现为对多种细菌有不同程度的抑菌作用。药理证明大黄能缩短凝血时间，止血的主要成分为大黄酚。大黄粗提物、大黄素和大黄酸对实验性肿瘤有抗癌活性。泻下的主要有效成分为番泻苷类。另外，大黄还含有鞣酸类化合物，含量为10-30%，有止泻作用。
大黄素（emodin）
大黄酚（chrysophanol）
芦荟大黄素（aloe-emodin）
二、目的
1.掌握蒽醌苷元的提取方法——两相水解法。
2.掌握pH梯度萃取法分离酸性成分的原理及操作技术。
3.掌握硅胶柱色谱法分离的原理和操作技术。
4.掌握羟基蒽醌类化合物的鉴定方法。
5.掌握蒽醌类化合物乙酰化和甲基化的原理和方法。
三、基本原理
大黄中蒽醌类化合物有结合态和游离态两种形式存在，主要化合物如下:
大黄酸(rhein)为黄色针状结晶，熔点为321-322℃，330℃分解。能溶于碱、吡啶，微溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醚和石油醚，不溶于水。
大黄素(ermodin)为橙黄色针状结晶)(乙醇或冰乙酸)，熔点为256 -257℃，能升华。易溶于乙醇、碱液，微溶于乙醚、三氯甲烷，不溶于水。
芦荟大黄素(aloe-emodin)为橙色针状结晶(甲苯)，熔点为223 -224℃。易溶于热乙醇，可溶于乙醚、苯、碳酸钠和氢氧化钠水溶液。
大黄酚(chrysophanol)为橙黄色六方形或单斜形结晶(乙醇或苯)，熔点为196-197℃，能升华。易溶于沸乙醇，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、苯、乙醚和氢氧化钠水溶液，微溶于石油醚、冷乙醇，不溶于水、碳酸钠和碳酸氢钠水溶液。
大黄素甲醚(physcion)为砖红色单斜针状结晶，熔点为203-207℃(苯)，溶于苯、三氯甲烷、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及乙酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
羟基蒽配苷类:大黄素甲醚葡萄糖苷(physion monoglucoside)，黄色针状结晶，熔点为235℃；芦荟大黄素葡萄糖苷(aloe-emodin monoglucoside)，熔点为239℃；大黄素葡萄糖苷(emodin monoglucoside)，浅黄色针状结晶，熔点为190-191℃；大黄酸葡萄糖苷(rhein 8-monoglucoside)，熔点为266-267℃；大黄酚葡萄糖苷(chrysophanol monoglucoside)，熔点为245-246℃，等。
大黄蒽醌存在的形式以结合状态为主，游离状态的仅占小部分，为了提高游离蒽醌的得率，在提取过程中采取酸水解和乙醚萃取相结合的方法（两相水解反应）。
依据大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的酸性强弱不同，采用强弱不同的的碱水萃取。苷元酸性强弱顺序如下：大黄酸>大黄素>芦荟大黄素>大黄素甲醚>大黄酚，所以可以用pH梯度萃取法分离。
依据大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚极性差异，可以用硅胶柱色谱法分离。苷元极性强弱顺序如下：大黄酸>芦荟大黄素>大黄素>大黄素甲醚>大黄酚。
四、仪器与试剂
1.仪器
水浴，圆底烧瓶(250 ml, 50 ml)，冷凝管，烧杯(100 ml，250 ml)，抽滤瓶(500 ml)，分液漏斗(500 ml)，旋转蒸发仪，紫外灯，展开缸，点样毛细管，循环水泵，锥形瓶(250 ml)，锥形瓶(50 ml, 15个)。
2.试剂
10%硫酸，乙醚，2.5% NaHCO3 2.5% Na2CO3，5% Na2CO3，0.5% NaOH，滤纸（5 x 8cm），薄层硅胶G，0.5%CMC-Na，浓盐酸，冰醋酸，丙酮，乙酸乙酯，氢氧化钾，硫酸二甲酯，三氯甲烷，无水硫酸钠，无水碳酸钾，无水吡啶，乙酸酐，乙醇，醋酸镁。
五、展开剂及对照品
1.展开剂
PE- EtOAc- HAc (6:4:0.2 或20:3:0. 6)。
2.对照品
大黄酸，大黄素，芦荟大黄素，大黄酚，大黄素甲醚。
六、操作方法
1.酸水解及总蒽醌苷元的提取
取大黄10 g，粉碎，加10%硫酸水溶液50 ml充分搅拌湿润，装入250 ml圆底烧瓶中，加乙醚50 ml 热水浴上回流提取1h，过滤得滤液，药渣继用乙醚50 ml回流提取1h，过滤，合并2次乙醚提取液(t) 于500 ml的分液漏斗中，加100 ml蒸馏水洗至中性备用。
2.蒽醌苷元类成分的分离
(1)方法一 pH梯度萃取法
大黄酸的分离和精制：将上述乙醚提取液（t），用2.5%碳酸氨钠水溶液120 ml分3次萃取，每次40 ml，充分振摇，静置至彻底分层，分出碱水层置250 ml的烧杯中，在搅拌下小心滴加浓盐酸至pH3 （观察萃取、酸化时溶液的颜色变化），放置沉淀，待沉淀析出完全后过滤，沉淀用水洗至近中性，干燥，称重，即为强酸部分，主要含有大黄酸。沉淀干燥后，样品加冰醋酸10 ml加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针晶为大黄酸。
大黄素的分离和精致：上述经碳酸氢钠萃取过的乙醚液(a)，用2.5%碳酸钠水溶液120 ml分3次萃取，每次40 ml，充分振摇，静置至彻底分层，分出碱水层置250 ml的烧杯中，在搅拌下小心滴加浓盐酸至pH3 (观察萃取、酸化时溶液的颜色变化)，放置沉淀，待沉淀析出完全后过滤，沉淀用水洗至近中性，干燥，称重，即为中等酸性部分，主要含大黄素。用15 ml的丙酮热溶，趁热过滤，滤液静置冰乙酸和乙酸的区别，析出橙色针晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。
芦荟大黄素的分离和精制：2.5%碳酸钠萃取过的乙醚液(b)，用5%碳酸钠水溶液120 ml分3次萃取，每次40 ml,分出碱水层置250 ml的烧杯中，调pH至3，放置沉淀，过滤，沉淀用水洗至近中性，干燥，称重，用10 ml乙酸乙酯精制，得黄色针晶芦荟大黄素。
大黄酚和大黄素甲醚的分离：萃取除去芦荟大黄素后余下的乙醚层(c)，再用0.5%氢氧化钠水溶液90 ml萃取3次，每次30 ml。合并氢氧化钠萃取液于250 ml的烧杯中，调pH至3，析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，称重，即为弱酸性部分，主要含大黄酚和大黄素甲醚。余下乙醚液(d)水洗至中性，蒸馏回收乙醚。
TLC跟踪检查
薄层板：硅胶G- CMC- Na。
展开剂: PE- EtOAc-HAc（6:4:0.2 或20:3:0.6）。
样品:乙醚液（t， a-d）。
(2)方法二硅胶柱色谱法
①装柱
取100 -200目柱层析用硅胶粉15 g，小漏斗法，下端活塞打开，倒入底部垫有少许精制棉花的2x 300 mm层析柱内，轻轻敲打层析柱，使柱内硅胶粉均匀充实，得干硅胶层析柱。
取100-200目柱层析用硅胶粉15 g于100 ml的烧杯中，用石油醚拌均匀至无气泡，倒人底部垫有少许精制棉花的20x 300 mm下端活塞打开的层析柱，轻轻敲打层析柱，流3个柱体积的石油醚，使柱内硅胶粉均匀充实，得湿硅胶层析柱。
②上样
取上述提取的总羟基蒽醌苷元乙醚液于250 ml圆底烧瓶中，浓缩至干，用少量乙醚转移至蒸发皿中，加柱层析用硅胶粉1 g，边搅拌边于通风橱中晾干，得均匀样品粉末，仔细加人硅胶层析柱的上端，轻敲层析柱使样品粉末平整，上加约0.5 cm厚的保护硅胶。
③洗脱与收集
首先，用石油醚-丙酮（9:1），或石油醚-乙酸乙酯(7:3) 混合溶剂洗脱，柱下用250 ml锥形瓶收集洗脱液。柱上黄色色带开始流出时，更换50ml锥形瓶， 10-15 ml为1流分，顺序编号。直至三个黄色色带流出，改用石油醚-丙酮（5:5）混合溶剂或乙酸乙酯洗脱至橙色色带流出为止。每个流分经薄层色谱检查，相同斑点者合并分别回收溶剂，浓缩放置析晶。
3.大黄素的三甲基化和三乙酰化
(1)三甲基化
方法一：将1.68 g（30 mM）氢氧化钾溶于3 ml蒸馏水中，加入大黄素2.7 g（10 mM），搅拌下慢慢滴加硫酸二甲酯3.78 g（30 mM），混合物回流反应2h。反应液用三氯甲烷(50 mlx3)萃取，无水硫酸钠干燥得粗产品，硅胶柱色谱分离纯化（流动相为体积比为3:1的石油醚-丙酮），三氯甲烷重结晶的黄色晶体，干燥，称重，计算收率，测定熔点。
方法二：向圆底烧瓶瓶中分别加入0.8 g（3 mM）大黄素，丙酮，12 g无水碳酸钾，不断搅拌下滴加8 ml硫酸二甲酯。混合物加热回流24 h，反应液浓缩至原体积的一半，加蒸馏水50 ml稀释，过滤收集黄色沉淀。母液蒸除大部分丙酮又可以得到一部分产物，合并粗产物，三氯甲烷重结晶，得大黄素三甲基化街生物，称重，计算收率，测定熔点。
(2) 三乙酰化
取大黄素200 mg，置于50 ml干燥圆底烧瓶中，加4 ml无水吡啶溶解，再加5 ml乙酸酐摇匀，水浴上加热回流30 min，放冷，将反应液在搅拌下倾入100 ml冰水中冰乙酸和乙酸的区别，一直搅拌至油滴消失，固体沉淀析出，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥后用95%的乙醇重结晶，得粉末状结晶。
4.鉴定
(1)化学鉴定
a.碱液试验：分别取上述分离所得游离蒽醌类化合物结晶各少许于小试管中，加95%乙醇1 ml溶解，再加10%氢氧化钠水溶液2-3滴，观察溶液颜色变化。
b.醋酸镁试验：分别取上述分离所得游离蒽醌类化合物结晶各少许于小试管中，加95%乙醇1 ml溶解，再加0.5%醋酸镁乙醇液2-3滴，观察溶液颜色变化。
(2)薄层色谱鉴定
吸附剂：硅胶G-CMC -Na板，于110℃烘半小时。
样品溶液：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚少量，以适量乙醇溶解。
对照品溶液：大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，以适量乙醇溶解。
展开剂：Pet-EtOAc-HAc（6:4:0.2或20: 3:0.6）
用毛细管各吸取样品和对照品溶液适量，点于同-硅胶 G薄层板上，用上述展开剂展开。薄层板吹干后，在日光和紫外光灯（365m）下观察色斑，再置于浓氨气中熏或喷5%醋酸镁乙醇溶液后，日光下检视，斑点变呈红色。
七、注意事项
1. 水解液酸性强，避免用手直接接触。
2. 分液漏斗使用前检查是否漏。
3. 柱色谱时玻璃器皿干燥，无水；装柱时，下端活塞应打开；洗脱剂不能低于柱。
4. 在大黄素三甲基化中，硫酸二甲酯和氢氧化钾的用量是关键，当其用量与大黄素的摩尔比为1:1时，主要产物为大黄素6位甲基化行生物，而摩尔比为3:1时，化合物大黄素三甲基化衍生物为主要产物。
八、思考题
1.试述大黄中5种游离羟基蒽醌类化合物的酸性和极性顺序，并说明理由。
2.试述pH梯度萃取法的原理，并说明适用于哪些中药成分的分离。
3.试述湿法装柱和干法装柱各有什么优缺点。
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