研究背景
厌氧消化（anaerobic digestion，AD）能够将特定微生物群落介导的各种有机化合物转化为甲烷。厌氧消化被广泛应用于污水畜禽粪便和城市有机废弃物处理等方面。微生物群落可分为发酵细菌（fermenters），互营细菌（syntrophs）和产甲烷古菌（methanogens）。Illumina测序方法的两个主要缺点限制了它在分类学鉴定中的分辨率。一是读长短，分类通常仅限于属级鉴定，二是由于16S rRNA基因拷贝数低,V4-V5引物集在扩增广古菌门16S rRNA基因效率低，其中包含了大部分产甲烷的菌种。因此需要更准确的分类学鉴定以了解AD微生物群落的复杂性。研究者使用PacBio Sequel对先前研究的AD样本进行测序分析并与Illumina MiSeq的结果进行比较。
材料和方法
样本：从5个国家不同规模的市政污水处理厂收集了总共19个厌氧消化池污泥样品，使用FastDNA SPIN试剂盒提取DNA
测序平台：PacBio Sequel
扩增区域：全长16srRNA基因（细菌27F/1492R引物进行扩增；古菌A1F；1490R引物）
测序数据量：总计113,970条CCS
01
总述
19个细菌和17个古菌扩增子测序获得的数据进行质量过滤和去除嵌合体后，总共获得了113,970条CCS序列。古菌和细菌序列的平均CCS长度分别为1493.43±81.31和1509.32±43.63 bp。选择SILVA rRNA基因数据库进行注释。总体而言，细菌群落的香农多样性和均匀度分别为5.27±0.88和0.78±0.10，而古菌群落的分别为2.95±0.79和0.60±0.05。同样，细菌群落中的Chao 1指数，ACE指数，Inverse Simpson和Inverse Simpson均匀度高于古菌，表明细菌群落中的α多样性高于其对应古菌群落。而且，PCoA结果表明，古菌群落主要根据操作条件聚集，而细菌群落的分布则更为随机。
02
古菌群落的多样性
使用古菌特异引物，大多数OTU(10,490个OTU中的10,446个)可以代表整个古菌序列的99.76%。到目前为止，所有培养的产甲烷菌都被归入广古菌门的7个目。在这7个目中，有3个目在本数据集中没有观察到，即Methanocelles、Methanopyrales和Methanococcales(图1A)。在中温消化池中发现了Verstraetearchaeota，这是以前在消化池中没有检测到的。它被认为是为数不多的非广古菌门产甲烷菌的例子之一。总而言之，得益于全长序列的高分辨率，一些被忽视的产甲烷菌被鉴定出来，需要进一步关注研究它们在AD中的作用。
图1.(A)在门或属水平上与产甲烷菌相关的OTUS的全长16S rRNA系统发育树
(B)在属水平上鉴定与互营菌相关的OTUS的全长16S rRNA系统发育树
03
操作驱动型产甲烷菌种
对相对丰度>1%的35个丰富的古菌OTU进行物种水平鉴定(图2A)，进一步探索它们的潜在功能，如产甲烷途径、最佳生长条件和底物利用(表S5)。在高盐度消化池(HKTP)中，鉴定出一个与Methanosarcina Horonobensis相关的OTU，同源性为98.67%，占古菌种群的72.51%。在所有的操作条件下，沼气池中均存在Methanothrix Conilii甲烷菌序列，平均丰度为18.63%，约占甲烷菌种群的一半。
04
互营菌群的多样性
在检测到的1601个互营菌相关OTU中消化池，它们与以下门相关：变形菌门（1339 OTU）、厚壁菌门（229 OTU）、互营菌门（9 OTU）和Ca. Cloacimonetes（24 OTU）。互营菌相关的OTU占细菌总数的4.69±3.88%，中温消化池为10.17%，40℃消化池为10.04%。
图2.在物种水平上，产甲烷菌相关的OTU，相对丰度> 1％
05
细菌群落的特征
覆盖了原核生物名录中23个已建立的门和30个候选门。拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门具有广泛的代谢潜力，分布广泛，种类繁多。11个候选门具有代谢重建的基因组信息，与产甲烷无关。LEfSe分析表明梭状芽孢杆菌纲的一个不同的类群，包括Lanchnospiracea、Peptococcaceae、Ruminococcaceae和uncultured D8A-2类群,，在高温消化池中有更显著的作用(图3A)。这些属的代表种可以在极端条件下生存消化池，如高温环境。网络图分析表明与梭状芽孢杆菌相关的OTU与一组与Coprothermobacteraeota相关的OTU共存(图4A)，假定它们是高温消化池中潜在的挥发性脂肪酸(VFAS)的生产者。
图3.LEfSe分析结果
图A显示了在不同操作条件下具有统计意义的分类群的分支图，图B显示了差异物种LDA值。
图4.网络图分析
每个节点表示具有99%序列相似性的OTU,节点的大小与它们的相对丰度成正比。
06
与Illumina MiSeq结果比较
对PacBio Sequel中的细菌长读序列和Illumina MiSeq中的短读序列(v4-v5)进行比较。结果表明：alpha和beta多样性的差异很小。对于alpha多样性，箱线图表明，虽然覆盖率较低（图5B），但长读结果的Shannon多样性的总体分布略高于短读，为了改善长读方法的覆盖范围，建议增加数据量；因此长读方法可以提供与短读方法等效且足够的覆盖度。对于系统分类而言，在相对丰度> 2％中，长读长结果中鉴定到了15个其他OTU，表明短读长测序低估了某些门。例如，在相同的样品中，短读长测序结果中的Ca. Patescribacteria 为0.34至2.75％， 而在长读长测序结果中为20.96至42.87％。
图5. alpha多样性和覆盖率(SR为Illumina MiSeq结果；LR为PacBio Sequel结果）
总结
该研究展示了使用PacBio Sequel处理低质量环境DNA样品进行全长16S rRNA基因扩增测序的方法。结果表明，全长扩增子为鉴定厌氧消化池微生物群落提供了较高的分辨率。在不同的环境中，突出的产甲烷菌种，即Methanosarcina horonobensis,Methanosarcina flavescens在各自的环境中均为优势种，证明了PacBio全长扩增子测序技术在物种水平鉴定的价值。通过基因组数据库的扩充、测序方案和化学方法的改进，全长测序技术在混合培养环境和工程样品中的应用前景更加广阔。
配图来源于网络/侵删
参考文献：
Lam T Y C, Mei R, Wu Z, et al. Superior resolution characterisation of microbial diversity in anaerobic digesters using full-length 16S rRNA gene amplicon sequencing[J]. Water Research, 2020: 115815.
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